（2）准备15ml离心管，并向其中加入8ml完全培养基（JYK-CT-0005M）待用；

　　（3）将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入恒温水浴锅中或者直接置于细胞复苏仪中；

　　（4）在恒温水浴锅中，用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化；在细胞复苏仪中，按照程序操作即可；

　　（5）用纸巾或无尘布擦拭水渍，75%酒精消毒后转移至生物安全柜或者超净工作台。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管；

　　（7）离心后弃上清，用新鲜完全培养基（JYK-CT-0005M）重悬细胞，混匀取样20ul计数后，根据实验需要接种至新的无菌培养器皿中；

　　（9）置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养，48h后镜检观察细胞复苏情况（贴壁情况）。

　　（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合度和生长状态，若细胞汇合至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；

　　（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；

　　（3）加入0.25%胰酶（JYK-SX-002）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养基中即可；

　　（4）加入完全培养基（JYK-CT-0005M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（JYK-SH-001）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体收集到一支离心管中；

　　（6）离心后弃上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，加入1ml完全培养基（JYK-CT-0005M）稀释并充分混匀；

　　（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数，根据接种密度计算所需细胞液体积；

　　（8）根据实验需要，吸取一定量的细胞液加入到培养瓶，加入完全培养基（JYK-CT-0005M）（T25瓶，加入10ml；T75瓶，加入20ml），轻轻前后摇匀，在瓶身写好细胞名、培养代数、日期、姓名；

　　（9）镜下观察看是否已经摇匀，无误后放入培养箱37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养。

　　（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合度和生长状态，若细胞汇合至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；

　　（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；

　　（3）加入0.25%胰酶（JYK-SX-002）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养基中即可；

　　（4）加入完全培养基（JYK-CT-0005M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（JYK-SH-001）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体收集到一支离心管中；

　　（6）离心后弃上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，加1ml预冷冻存液（JYK-SD-003）混匀；

　　（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数；

　　（8）根据计数结果，添加冻存液（JYK-SD-003），调整细胞最终密度为3×106/ml；

　　1.建议接种密度为2-5×10⁴cells/cm²，避免密度过低导致生长缓慢或过高引起接触抑制。

　　2.根据需要添加EGF（表皮生长因子）或bFGF（碱性成纤维细胞生长因子），促进细胞增殖。